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    全基因合成常見問題解答
    合肥博美生物科技有限責任公司 / 2015-03-02

     

                                                                                   全基因合成常見問題解答
     
    1.堿基序列對全基因合成的影響 
    1. 長片段重復。大量的長片段重復很可能會延長基因合成的時間,甚至導致基因完全無法合成。 
    2. 高GC%?;騼炔康木植扛逩C%會嚴重影響PCR擴增和測序。 
    3. 二級結構。堿基序列的反轉、重疊等會嚴重影響PCR擴增,在測序時也可能會因此而測不通或信號突然中斷等。 
    4. 測序引物與基因內部的特殊序列結合導致無法正常測序,必須重新設計測序引物。 
    對策: 對密碼子進行優化,盡量減少基因序列中的重復序列,高GC%區和二級結構區。 
     
    2.PCR出現非特異性擴增帶 
    1. 引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。 
    2. Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數過多。 
    3. 酶量過多出現非特異性擴增。 
    對策: 
    1. 重新設計引物。 
    2. 減低酶量或調換另一來源的酶。 
    3. 降低引物量,適當增加模板量,減少循環次數。 
    4. 適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性,65左右退火與延伸)。 
     
    3.PCR出現片狀拖帶或涂抹帶 
    1. 酶量過多或酶的質量差。 
    2. dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多。 
    對策: 
    1. 減少酶量,或調換另一來源的酶。 
    2. 減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度,減少循環次數。 
     
    4. DNA沒有被限制性內切酶切開或者切割不完全 
    1. 缺少識別序列。 
    2. 反應條件不合適。 
    3. 限制性內切酶對DNA甲基化敏感。 
    4. 內切酶稀釋不正確或加入方法不正確。 
    5. 甘油濃度過高。 
    6. 限制性內切酶已部分或全部失活。 
    對策: 
    1. 檢查底物DNA中是否存在可被限制酶識別的DNA序列。 
    2. 使用隨酶提供的反應緩沖液;增大酶量。 
    3. 檢查DNA是否已被甲基化以及所用的限制性內切酶是否對甲基化敏感。 
    4. 限制性內切酶經稀釋緩沖液稀釋后應在當天用完;限制性內切酶通常在最后加入。 
    5. 更換新酶進行實驗。 
    6. 酶的體積不能超過反應總體積的1/10。 
     
    5.電泳后電泳條帶擴散,電泳條帶移動距離異常 
    1. 底物DNA不純。 
    2. 限制性內切酶不純。 
    3. 酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結合在一起使電泳條帶移動距離異常。 
    對策: 
    1. 用另外一種限制性內切酶與底物DNA溫育作為對照 
    2. 用產品說明中的底物DNA來檢測酶活性,如果電泳后條帶仍擴散,說明不正確的操作已使內切酶污染。 
    3. 電泳前用終濃度為0.1%的SDS在65與底物DNA溫育10min。 
     
    6.連接效率不高 
    1. 連接緩沖液已變質。 
    2. 限制性內切酶在連接混合物中仍具活性。 
    3. 非特異性的核酸酶污染。 
    4. 連接酶濃度太低。 
    對策: 
    1. 用新鮮的連接緩沖液重新進行連接反應。 
    2. 如果限制性內切酶在65溫育下熱穩定,酶切后應該用酚來去除去蛋白并用乙醇沉淀DNA。 
    3. 判斷連接反應混合物中哪種組分被污染,然后逐一將其替換。 
    4. 在連接反應中增大連接酶的用量(0.3-0.6 Wu/1μg),并同時使用10%PEG。酶切后用酚抽提底物DNA中的蛋白。 
     
    7.質粒及其菌株的運輸保存 
    我們為您提供含有完全正確的基因序列的質粒(不少于1ul)、甘油菌(含40%甘油)和穿刺菌各一份。在運輸過程中,質粒、甘油菌和穿刺菌均須保證低溫運輸。在實驗室內,穿刺菌應在0~4保存;甘油菌應在-70以下保存;質粒應在-20以下保存,并盡量避免反復凍溶。 
     
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